凝膠過濾色譜

摘要：本文主要講解了凝膠過濾色譜法（分子篩）在蛋白純化實驗中的應用，包括純化原理、實驗方案設計、技術操作以及相關案例介紹和問題分析。

基本原理

凝膠過濾色譜蛋白純化法，又稱為空間排阻色譜，分子篩等。其原理是應用蛋白質分子量或分子形狀的差異來分離。當樣品從色譜柱的頂端向下運動時，大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒從而被迅速洗脫；而較小的蛋白質分子能夠進入凝膠顆粒中，且進入凝膠的蛋白在凝膠中保留時間也不同，分子量越大，流出時間就越早，最終分離分子大小不同的蛋白質。

通常，多數凝膠基質是化學交聯的聚合物分子制備的，交聯程度決定凝膠顆粒的孔徑。常用的色譜基質有：葡聚糖凝膠（Sephadex）、瓊脂糖凝膠（Sepharose）、聚丙烯酰氨凝膠（Bio-Gel P）等。高度交聯的基質可用來分離蛋白質和其他分子量更小的分子，或是除去低分子量緩沖液成分和鹽，而較大孔徑的凝膠可用于蛋白質分子之間的分離。選用合適孔徑的凝膠很大程度取決于目標蛋白的分子量和雜蛋白的分子量。

實驗方案設計

1. 凝膠介質的選擇
   凝膠介質的選擇主要是根據待分離的蛋白和雜蛋白的分子量選擇具有相應分離范圍的凝膠，同時還需要考慮到分辨率和穩定性的因素。比如，如果是要將目的蛋白和小分子物質分開，可以根據他們分配系數的差異，選用Sephadex G-25和 G-50；對于小肽和低分子量物質的脫鹽，則可以選用Sephadex G-10、G-15以及Bio-Gel P-2或P-4；如果是分子量相近的蛋白質，一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質的凝膠。具體凝膠過濾色譜介質應用如下：

   常用凝膠過濾色譜介質的分離范圍
   凝膠介質	蛋白質的分離范圍/103	凝膠介質	蛋白質的分離范圍/103
   Sephadex G25 Sephadex G50 Sephadex G100 Sephadex G200 Sepharose 6B Sepharose 4B	1~5 1.5~30 4~150 5~600 10~4000 60~20000	Sepharose 2B Bio-Gel P-4 Bio-Gel P-10 Bio-Gel P-60 Bio-Gel P-150 Bio-Gel P-300	70~40000 0.5~4 5~17 30~70 50~150 100~400

2. 凝膠介質的預處理
   凝膠在使用前應用水充分溶脹（膠：水=1：10），自然溶脹的耗時較長，可采用加熱的方法使溶脹加速，即在沸水浴中將凝膠升溫至沸，1~2h即可達到溶脹。在燒杯中將干燥凝膠加水或緩沖液，攪拌，靜置，傾去上層混懸液，除去上清液中的凝膠碎塊，重復數次，直到上清澄清為止。
3. 色譜柱的選擇
   色譜柱的體積和高徑比與色譜分離效果密切相關，凝膠柱床的體積、柱長和柱的直徑以及柱比的選擇必須根據樣品的數量，性質和分離目的進行確定。組別分離時，大多采用2~30cm長的色譜柱，柱床體積為樣品溶液體積的5倍以上，柱比一般在5~10之間；而分級分離一般需要100cm左右的色譜柱，并要求柱床體積大于樣品體積25倍以上，柱比在20~100之間。
4. 凝膠柱的填裝
   凝膠色譜柱與其它色譜方法不同，溶質分子與固定相之間沒有力的作用，樣品組分的分離完全依賴于他們各自的流速差異。裝住時關住柱子下口，在柱內加入約1/3柱床體積的水或緩沖液，然后沿著柱子一側將緩沖液中的凝膠攪拌均勻，緩慢并連續的一次性注入柱內。待凝膠沉積約5厘米左右時，打開柱子下口，控制流速在1ml/min。
5. 樣品的處理與上樣
   根據樣品的類型和純化分析，需要選擇合適的緩沖液，為了達到良好的分析效果，上樣量必須保持在較小的體積，一般為柱床體積的1%~5%，蛋白質樣品上樣前應進行濃縮，使樣品濃度不大于4%（樣品濃度與分配系數無關），但需要注意的是，較大分子量的物質，溶液粘度會隨濃度增加而增大，使分子運動受限，影響流速。上樣前，樣品要經濾膜過濾或離心，除去可能堵塞色譜柱的雜質。
6. 洗脫與收集
   凝膠過濾色譜的緩沖液用單一緩沖液或含鹽緩沖液作為洗脫液即可，主要考慮倆個方面的原因：蛋白的溶解性和穩定性。所用的緩沖液要保證蛋白質樣品在其中不會變性或沉淀，PH應選在樣品較穩定、溶解性良好的范圍之內，同時緩沖液中要含有一定的鹽（NaCL），對蛋白質起穩定和保護作用。洗脫過程中始終保持一定的操作壓，流速不可過高，保持在0.5~3.0mL/min即可。

案列介紹

AKTA凝膠過濾色譜分離蛋白質

材料

色譜介質：Sephacryl S-200，蛋白質分離范圍（5~250）×103

色譜柱：XK16/60預裝柱
色譜設備：AKTA Explorer
混合樣品：含單克隆抗體，分子量180000；牛血清白蛋白（68000），溶菌酶（14000）
NaOH 0.5 mol/L
NaCl 200 mmol/L
PB 20 mmol/L
PH7.0 緩沖液

方法

1. 凝膠除菌處理：超純水沖洗柱子后，用0.5mol/L NaOH正向沖洗柱，流速3mL/min，沖洗3柱體積
2. 平衡：NaOH處理完畢后，用超純水沖洗2柱體積，接著用含200mmol/L NaCl和20mmol/L PB的7.0PH緩沖液沖洗5~10倍柱體積
3. 上樣：平衡完畢后，選擇樣品泵進行上樣，上樣流速3mL/min，上樣體積為1mL
4. 洗脫：上樣結束后，用平衡緩沖液進行洗脫
5. 清洗與保存

純化結束后，用0.5mol/L NaOH反向沖洗2柱體積，沖洗時間30~60min，沖洗結束后，用超純水正向沖洗5柱體積，再用20%乙醇沖洗3柱體積，然后拆下柱子，兩端封死，低溫保存。

問題分析和解決方案

1. 色譜分離前如何凈化樣品

在色譜分離前，對樣品進行離心和過濾，離心能除去大部分塊狀物，如果離心后樣品仍不清澈，可用濾膜過濾。由醋酸纖維薄膜或PVDF材料制成的濾膜能夠非特異性的結合少量蛋白。

2. 溶液交換不徹底

嚴格控制上樣體積，上樣體積不超過柱體積30%。
若樣品溶液體積較多，可以分多次上樣，注意每次上樣時間間隔，可根據電導色譜峰確定下一次上樣時間。

3. 分辨率不高

1)提高裝柱質量，使色譜柱裝填勻實；

2)提高柱床高度；

3)控制上樣體積，最大上樣體積不超過柱床體積5%；

4)控制樣品黏度與洗脫溶液黏度保持一致；

5)根據樣品特點選擇合適的洗脫溶液，調節洗脫溶液的離子強度或親水性；

6)選擇合適的凝膠柱（如何選擇請參照上文）

4. 色譜峰對稱性差

1)提高裝柱質量，裝柱勻實——若柱裝的太松，容易引起拖尾，裝的太緊，會引起前沿；
2)柱較臟，再生色譜柱

5. 肩峰出現的原因及解決方法

1)柱床松動，重新裝柱或反向沖洗柱
2)柱篩板堵塞，超聲清洗篩板
3)柱干裂，重新裝柱

更多有關蛋白純化資料，請訪問：純化資料專區