全人源化單克隆抗體制備技術（轉基因小鼠）

摘要：本文對全人源化單克隆抗體制備技術中的轉基因小鼠技術進行概述和整理，主要內容包括轉基因小鼠制備全人單抗原理簡介，優缺點的對比以及四種常用的實驗方法介紹。

轉基因小鼠制備全人單抗原理簡介

轉基因小鼠制備全人源抗體的實驗原理是：在抗體生成過程不是從普通小鼠開始，而是從鼠抗體生成基因被相應人基因所取代的小鼠開始。該方法要求人的抗體基因片段在小鼠體內必須進行較為有效的重排與表達，并且這些片段能與小鼠細胞的免疫系統信號機制相互作用，使得小鼠在受抗原刺激后，這些人抗基因片段能被選擇，表達并活化B細胞分泌人抗體。其基本方法是采用在鼠胚胎干細胞（ES）中的同源重組來使得鼠原有基因缺失，再通過顯微注射等技術將重建的人源抗體胚系基因微位點轉入小鼠體內，最終由mAb的雜交瘤分泌出全人序列的抗體。

優勢與缺點對比

轉基因小鼠制備全人源抗體的主要優點是，其功效要優于其他生產抗正常人體蛋白mAb技術。小鼠識別抗原和動員抗該抗原的抗體系統仍保持完整，容易把人體蛋白識別為異物。而且，由于抗體是在體內產生，經歷正常裝配和成熟過程，從而保證成品具有較高的靶結合親和力。另一方面，用轉基因小鼠生產候選mAb藥物時間較短，費用較低。
轉基因小鼠技術目前主要存在以下幾個問題。一是免疫耐受的問題， 雖然可以通過免疫佐劑的使用和免疫方法的改進來提高免疫反應強度，但對于一些人類抗原仍然較難獲得高親和力抗體； 二是上述提到的存在鼠源抗體干擾的問題； 三是存在對毒性抗原較難進行免疫等問題。

常用的技術方法

1.原核顯微注射法

該法又稱DNA顯微注射法，即通過顯微操作儀將外源基因直接用注射器注入受精卵，利用外源基因整合到DNA中，再通過胚胎移植技術將轉基因胚胎移植到代孕受體動物子宮中，經過體內發育獲得轉基因動物。該方法的特點是外源基因的導入整合效率較高，不需要載體，直接轉移目的基因，目的基因的長度可達200kb，較少產生嵌合體等。它可以直接獲得純系，所以實驗周期短。

然而該方法有一些缺點使其很難在大動物中廣泛應用：(1)顯微操作儀器昂貴；(2)技術操作復雜，要求經過專門訓練的技術人員操作儀器；(3)顯微注射導入的外源基因在基因組中隨機整合，可能導致內源性功能基因突變或者激活一些致癌基因，無法調控外源基因在基因組中的整合數目(拷貝數)；(4)外源基因整合效率較低，構建轉基因大動物成本較高；(5)只能實現目的基因的整合，不能進行基因敲除研究。盡管如此，在體細胞核移植技術出現前，顯微注射法是被廣泛使用和效果最好的轉基因技術。

2.逆轉錄病毒載體法

逆轉錄病毒感染法是最早被用于制備轉基因動物的方法。常用的病毒載體包括逆轉錄病毒載體和慢病毒載體。

該方法首先將目的基因片段克隆至病毒載體的長末端重復序列(long terminal repeat，LTR)的下游，利用病毒系統將含有目的基因的載體包裝成高滴度的病毒顆粒，以該病毒顆粒侵染動物受精卵或者胚胎， 也可以直接將胚胎與能釋放逆轉錄病毒的單層培養細胞共孵育以達到感染的目的， 通過病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中去。這種逆轉錄病毒被用重組DNA技術修飾后作為基因載體在應用中優于微注射法之處為：無需重排， 可在整合點整合轉移基因的單個拷貝；將胚胎置于高濃度病毒容器中， 或者與被感染的細胞體外共同培養， 或微注射雞胚盤里，整合有逆轉錄病毒的DNA的胚胎率高。但是逆轉錄病毒載體具有感染宿主較窄，產生嵌合體動物的概率高等缺點，限制了其在轉基因動物制備中的應用。隨著病毒載體的發展，目前慢病毒載體逐漸成為病毒載體法的主導方法。

與一般的逆轉錄病毒載體法相比，慢病毒載體法具有感染宿主范圍廣，可感染幾乎所有類型的細胞(分裂細胞和非分裂細胞)，一般對細胞的感染力可達90%以上，具有較強的基因組整合能力。外源基因整合進入基因組織，可以穩定遺傳。2010年，劉明軍等利用慢病毒載體法制備轉基因綿羊，對新生的162只羔羊進行檢測，發現其中92只為轉基因羔羊，平均轉基因效率高達56.8%，顯示出慢病毒法高效制備轉基因動物的優勢。但是慢病毒自身有潛在的致癌性，安全性有待提高，病毒載體容量不夠大，目前只能插入小于10kb的外源基因。

3.精子介導法

近年來利用精子作為外源基因的載體來建立轉基因動物極為令人注目。其方法就是將成熟的精子與外源DNA進行預培養之后， 使精子有能力攜帶外源DNA進入卵子中， 使之受精， 并使外源DNA整合于染色體中。精子攜帶DNA主要是通過三種途徑來完成， 即將外源DNA與精子共孵育、電穿孔導入法和脂質體傳染法。該方法簡單、方便， 依靠生理受精過程， 免去了原核的損傷。1989年Lavitrano等首次利用小鼠附睪精子與DNA溫育產生轉基因小鼠。轉基因效率高達30%， 外源基因穩定整合到生殖細胞中， 由此獲得了轉基因株系。所以這些引起了廣大科研工作者的極大興趣， 以精子作為載體、針對不同動物品種的研究工作相繼展開。

4.酵母人工染色體法

YAC系統是1987年發展起來的。該技術主要是將未重排的人類免疫蛋白胚系基因，首先構建成酵母人工染色體(yeast artificial chromosome，YAC)，并把其轉人小鼠即可獲得分泌人抗體的轉基因鼠。Mendez等采用改進的細胞融合法：去掉含有YAC的酵母細胞壁，使其球狀原生質與鼠胚干細胞(ES融合)。然后把整合有目的基因的ES細胞導人小鼠囊胚，使之發育為嵌合體小鼠，再通過轉基因鼠間反復交篩選，最終可獲得分泌完全人抗體的小鼠。分別以人白細胞介素-8(IL-8)、表皮生長因子受體(EGFR)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和淋巴細胞表面抗原(CD4)等抗原免疫該鼠，再取其脾細胞以雜交瘤技術與鼠骨髓瘤細胞融合。經篩選獲得針對上述抗原的分泌高效價人抗體的雜交瘤細胞株。該技術明顯優于微基因重組法，所獲抗體的親和力顯著提高。但由于大量Ig相鄰基因片段的同源重組過程復雜，以及包含所有Ig恒定區基因的YAC克隆困難，到目前還不可能把所有人Ig基因轉入小鼠，故產生的抗體類型有限，僅能產生IgM和IgG2。

參考資料：

1.孫志偉, 王雙, 陳惠鵬. 轉基因小鼠在抗體藥物研發中的應用. 軍事醫學科學院生物工程研究所, 2012

2.吳玉龍, 趙冬梅. 全人源抗體制備技術研究進展. 濱州醫學院人體寄生蟲學教研室, 2005

3.王鋒, 倪培華, 宋巍, 周同. 利用轉基因小鼠及轉染色體小鼠產生人抗體的研究進展. 上海第二醫科大學附屬瑞金醫院, 2001

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