大腸桿菌表達系統

本文主要介紹了大腸桿菌蛋白表達原理、具體操作步驟、大腸桿菌表達系統及其與其他系統的比較等。

大腸桿菌蛋白表達原理

誘導原理：Lac阻遏物是一種具有4個相同亞基的四級結構蛋白，都有一個與誘導劑結合的位點。在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處于阻遏狀態，Lac阻遏物能與操縱基因O結合，阻礙RNA聚合酶與P序列結合，抑制轉錄起動。而當有誘導劑與阻遏蛋白結合后，其蛋白構象就發生變化，導致阻遏物從操縱基因O上解離下來，RNA聚合酶不再受阻礙，發生轉錄。詳情見IPTG誘導蛋白表達的原理

大腸桿菌表達系統步驟

不包括基因構建等上游操作和蛋白純化部分?；驑嫿▍⒖?a href="http://www.ipp2p.com/gene-expression-optimization.html">密碼子優化，蛋白純化參考蛋白純化專題。以下內容主要包括蛋白表達鑒定：
1. ?表達鑒定第一天的任務，常用抗性選擇根據感受態細胞選擇

• 拿到質粒，離心（3000r/min；2min）
• 在質粒中加入TE（使質粒最終加入到110μL感受態細胞中的量為80-100ng，據此確定加入TE的量），一般為（1μg質粒加20μLTE；2μg質粒加50μLTE；5μg質粒加100μL?TE）
• 將質粒與TE混勻，加入2μL混液于感受態細胞中
• 將感受態細胞放入冰箱（4℃）中，30min
• 取出后立即放入水浴鍋中（42℃），熱激90s,
• 再次放入冰箱（4℃）中，3min
• 拿出后取200μL的LB液體培養基加入到已轉入質粒的感受態細胞中
• 放入搖床（37℃;??195r）中,??30nim至60min; （最佳45min）
• 取出離心（3000r/min；2min）
• 去掉200μL的上清，留100μL左右上清懸浮沉淀，吸取50μL懸液涂平板，（先將對應抗性的平板放入培養箱（37℃）中預熱20min）
• 把平板放入培養箱（37℃），過夜（12h至16h）

2. ?表達鑒定第二天的任務,注意Pcold的表達溫度

• 每個平板挑取單菌落至4支對應抗性的L（4ml）試管中，編號為“0”“1”“2”“3”
• 將試管放入搖床（37℃；195r）中，（單抗3h左右；雙抗4左右；剛開始用可見分光光度計測OD值；熟練后可目測（背光下，以試管中的槍頭為例，剛剛看不見槍頭即可）），測OD值（0.6至0.8）
• 從“0”號管中取700μL懸液加入到100μL（C=80%）的保種甘油中，震勻，放入冰箱（-20℃）凍存
• 在每組菌的“1”“2”“3”號試管中分別加入2μL的IPTG（終濃度0.5mM最適）
• 視不同的載體選擇適合的表達環境（PET/PGEX：15℃表達過夜；25℃表達6h；37℃表達3h至4h（4支試管，“0”“1”號試管15℃表達過夜；“2”“3”試管37℃表達3h至4h）。Pcold：全部15℃表達過夜）

3. 表達鑒定第三天，全菌的表達鑒定分析，注意控制溶質的量及溶液黏度

• 從每組4支的試管中均取500μL菌液加入到1.5ml離心管中，（若OD值不一樣，值小的可多?。╇x心（6000r/min），5min,?去上清，留沉淀（沉淀少的，可再取菌液離心，盡量使沉淀量接近）
• 在每個離心管中加入500μL的DDH2O,懸浮沉淀，離心（6000r/min），5min,?去上清，留沉淀
• 在每支離心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading?Buffer懸浮沉淀（當溶質適量且均一的情況下，加入量不變；當溶質多且粘稠時，應使加入量增大，為降低粘度也可減少上液量）
• 放入煮樣器（100℃）?25min
• 取出后離心（6000r/min)??3min, ?電泳檢測。

大腸桿菌表達系統

• 質粒載體：小型環狀DNA，能自我復制。一個完整的質粒載體必須要有復制起點、啟動子、插入的目的基因、篩選標記以及終止子；此外對大腸桿菌表達載體的要求是：①操縱子以及相應的的調控序列，外源基因產物可能會對大腸桿菌有毒害作用；②SD序列，即核糖體識別序列，一般SD序列與起始密碼子之間間隔7-13bp翻譯效率最高；③多克隆位點以便目的基因插入到適合位置。
• 目的基因：在大腸桿菌表達體系中要表達的基因即外源基因，包括原核基因和真核基因；原核基因可以在大腸桿菌中直接表達出來，但是真核基因含有內含子不能，大腸桿菌不能對mRNA進行剪切，從而形成成熟的mRNA，所以真核基因一般以cDNA的形式在大腸桿菌表達系統中表達。此外還需提供大腸桿菌能識別的且能轉錄翻譯真核基因的元件。
• 表達宿主菌：表達蛋白的生物體即大腸桿菌。表達宿主菌的選擇在大腸桿菌蛋白表達過程中是很重要的因素——多數人會直接選擇實驗室曾經用過的宿主菌，而不去追究原因。對于宿主菌的選擇主要根據宿主菌各自的特征及目的蛋白的特性，例如目的蛋白需要形成二硫鍵，可以選擇Origami?2系列，Origami能顯著提高細胞質中二硫鍵形成幾率，促進蛋白可溶性及活性表達；目的蛋白含有較多稀有密碼子可用Rosetta?2?系列，補充大腸桿菌缺乏的七種（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA?及CGG）稀有密碼子對應的?tRNA，提高外源基因的表達水平。

大腸桿菌表達系統種類

• T7大腸桿菌表達系統

以T7啟動子、T7RNA聚合酶等T7噬箘體轉錄體系的元件為核心構建的表達系統。T7?RNA聚合酶一種高活性的RNA聚合酶，mRNA的合成速度比大腸桿菌內的RNA聚合酶快5倍，并某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶轉錄的序列也可以轉錄，所以T7?RNA聚合酶和T7噬箘體啟動子的存在的情況下，大腸桿菌本身的轉錄競爭不過T7噬箘體轉錄體系，最終受T7噬箘體啟動子控制基因的轉錄。

• Lac和Tac大腸桿菌表達系統

它是以大腸桿菌lac操縱子調控機理為基礎設計、構建的大腸桿菌表達系統，具有多順反子結構，結構排列為：

啟動子（lacP）-?操縱基因（lacO）?–?結構基因（lacZ-lacY-lacA）

原理：在無誘導物的情況下，負調節因子lacI基因產物形成四聚體阻遏蛋白與啟動子下游的操縱基因緊密結合，阻止轉錄的起始。加入誘導劑后，IPTG與lacI基因產物結合，使操縱基因解離出來，lac操縱子的轉錄因此被激活。用tac啟動子構建的表達系統稱為Tac表達系統。

• PL和PR大腸桿菌表達系統

以啟動子PL、PR為核心構建的表達系統。PL和PR表達系統具有很強的啟動轉錄能力，誘導時不需要加入化學誘導劑，成本低廉，但在熱刺激過程中，大腸桿菌中的一些蛋白水解酶會被激活，降解所表達的外源蛋白；其次是在大規模發酵培養菌體時，通過熱平衡交換方式提高溫度，需要較長的時間，這會降低誘導效果，從而對重組蛋白的表達量有影響。

此外還有其他表達系統，如pH調控型、營養調控型、糖原調控型等。

大腸桿菌表達系統比較

大腸桿菌與其他表達系統比較

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