原核表達最常見的12個問題解析

摘要：根據各個原核表達研究者所提出的問題，我們就原核蛋白表達純化進行了扼要的總結。

我不知道我的蛋白它有什么特性及其結構？

1. 首先，你要確定一件事，那就是這幾個蛋白質有人研究過沒有 ？還是最新發現的蛋白質？如果沒有人研究過，那就得用先測部分氨基酸，然后設計引物克隆了。
2. 如果有人研究過，那就好了可以根據軟件來預測。如有swiss—pdb軟件，但這個是要有氨基酸序列，知道基因序列，可以在ncbi上進行blastx，得到蛋白。

如何選擇蛋白表達宿主菌？

原核系統和真核細胞偏愛的密碼子有不同，因此，在用原核系統表達真核基因的時候，真核基因中的一些密碼子對于原核細胞來說可能是稀有密碼子，從而導致表達效率和表達水平很低。一般選擇菌主可看下表：

質粒測序正確，蛋白無法表達

1. 分析一下稀有密碼子，如果比較多，可以嘗試rosetta（DE3）
2. 可能是基因本身的問題。RNA3’的特殊結構可能導致轉錄出現問題，這種情況可以嘗試融合表達，譬如pET-32a。
3. 也許是表達量太低，也可以試一下western blot，定性的檢測一下。

如果IPTG誘導后細胞停止了生長，是不是表示細胞死了？

T7 RNA聚合酶非?；钴S，T7轉錄和翻譯信號極強，因此，一旦誘導，細胞的主要生理活動都向著目的蛋白表達的方面轉化。在通常情況下，細胞將停止生長，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成試驗可以用來檢測表達系統的性能。也有一些例外情況，例如特別的目的基因以及一些極為嚴緊的載體/宿主菌組合 （比如含有pLysE的宿主菌）等，這時在誘導后菌落還是會繼續生長。

如何提高重組蛋白在原核細胞里的表達水平，特別是可溶性表達？

這個問題是最困擾做原核蛋白表達純化的人的。比如大腸桿菌表達蛋白本身表達量就大，但是表達的大都是包涵體，想要獲得可溶性蛋白，就需要做復性，或是再設計實驗時就想辦法讓其在上清中表達。一般就要通過基因優化，載體宿主優化篩選，表達條件優化，誘導條件優化等等。

1. 降低重組蛋白合成的速率
   可溶性蛋白的產率取決于蛋白的合成速率，蛋白的折疊速率，以及聚集的速率。高水平表達時，肽鏈聚集的速率一旦超過折疊速率，就會形成包涵體。因此，降低重組蛋白合成的速率有利于提高重組蛋白的可溶性表達。
2. 密碼子優化
   密碼子優化就是根據表達系統對密碼子的偏好性進行優化篩選。經過優化的基因序列往往能提高mRNA二級結構的穩定性，有利于新生肽段的正確折疊，提高外源活性蛋白的表達。。
3. 表達溫度的選擇
   大腸桿菌的最適生長溫度在37～39℃之間，但此溫度下極易生成包涵體蛋白，降低可溶性蛋白的表達，而低溫培養條件下表達外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例。
4. 誘導條件優化
   搖瓶培養時，應選用低菌體濃度誘導，因為在低菌濃度下菌體處于對數生長期，生長活躍，有利于表達可溶性蛋白。然而，如果能保證合理的補料與充分的通氣，在較高菌濃度下誘導也同樣可能獲得可溶蛋白的高效表達。在某些情況下，誘導劑的流加能顯著提高可溶蛋白的表達水平。

目的蛋白總是以不可溶的形式出現

在原核蛋白表達純化中目的蛋白經常發生錯誤的折疊，并聚集成為包涵體。經過誘導，目的蛋白通?？蛇_細胞總蛋白的50%以上。雖然有一定比例的蛋白以可溶的單體形式存在，而多達95%（甚至更多）的蛋白則在包涵體中。實踐中，有很多實驗室采取降低誘導溫度，例如25–30°C，或降低IPTG濃度(0.01–0.1mM)并延長誘導時間，還有采用特別的培養基等方法獲得更多的可溶蛋白。然而，讓目的蛋白以包涵體形式聚集也并非總是壞事。不溶態在某些情況下非常有利：

1. 形成包涵體是目的蛋白表達量很高的表現。
2. 作為初步分離，將目的蛋白的包涵體純化出來非常簡便。用核酸酶處理，并經簡單洗滌，通?？梢垣@得純度達75–95%的目的蛋白。
3. 存在于包涵體中的目的蛋白通?？梢悦庥诘鞍酌傅乃馄茐淖饔?。

研究者采用下述方法加強蛋白重折疊的效果，并在很多蛋白上取得了好結果，可以嘗試以下：當蛋白還結合在樹脂上時，使用6M–8M梯度鹽酸胍、1mM還原型及0.2mM氧化型谷胱甘肽處理，繼而用咪唑正常洗脫。有些實驗室在透析去除變性劑的過程中加入底物或類似物，也有幫助酶折疊的效果。

我要的是全長蛋白，怎么還有截短的產物，這是怎么回事？

1. 一個最直接原因就是蛋白水解了。
2. 然而第二點翻譯起始也非常有可能。起始密碼子AUG (Met) 的上游在RNA編碼區有類似于核糖體結合位點序列(AAGGAGG)的間隔序列(通常是5–13個核苷酸)時，容易出現這種問題。截短蛋白在純化全長蛋白的操作時往往造成麻煩。解決途徑之一即是選用兩端都帶有融合標簽的pET載體，例如pET-28和pET-30系列載體在N-端和C-端都有His-Tag。這樣，全長蛋白就可以通過提高咪唑濃度，在洗脫時將截短蛋白與全長蛋白區分開。pET-29和pET-30系列載體在N-端融合有HiS-Tag序列而C-有His-Tag，因此可以先后用固定化S-蛋白和His- Bind樹脂親和純化以獲取全長蛋白。

His標簽包在蛋白質結構內部還能用蛋白酶切除嗎？

一般重組蛋白純化標簽被包在內部，可以增加所提的蛋白質樣品的溶解度，比如適量增加變性試劑濃度或類型使得蛋白質的肽鏈松散開暴露出（組氨酸）6標簽。另外，還可以加大離子型、非離子型或兩性離子表面活性劑的濃度或類型，加大DTT濃度（DTT濃度<1mmol/L，否則DTT會與Ni²⁺結合），適當調整調高鹽濃度（氯化鈉溶液低于2mol/L，從低濃度到高濃度逐漸分梯度上升），總之，作用就是增加蛋白質的可溶性，因為his6的親水性較強，增加可溶性之后his6容易暴露在水相。加大DTT濃度也可以切斷二硫鍵使得蛋白質的肽鏈松散，進而使his6容易暴露在水相，從而方便純化和酶切。再者重新構建，不加His-tag。

目的蛋白大于100kd或含有多個亞基，是否可以用原核表達系統？

在細菌中已經非常成功底表達了很多大蛋白。多亞基復合物則可以通過分別表達各亞基，然后在有尿素的溶液中，將各組分以適當比例混和，再透析除去變性劑。

是否所有的位點特異性蛋白酶都有一樣的酶切特性，只是識別位點不同？

位點特異性蛋白酶(例如凝血酶、腸激酶和Xa因子)通常被用來切割融合蛋白。這些酶的活性和第二點酶切傾向性很不相同。凝血酶在這三種中是特異性活性最高的，能夠有效切質量比僅為1:2000的蛋白。Xa因子似乎對于切點周圍的序列很敏感，經常會出現特異性位點切割不理想卻發生別的位點被切割的情況。腸激酶的專一性是上述三種中最好的，但由于切割效率低（通常要求質量比達到1:10）而顯得比較昂貴。另一個需要考慮的問題是：切割完成之后，是否需要去除蛋白酶。在質量比比較高的酶切反應進行完后，通常要通過色譜法處理。比較方便可行的方法是采用生物素化凝血酶結合鏈親和素瓊脂糖一起使用。盡管沒有一種蛋白酶完美無缺，凝血酶還算的上是活性高、專一性好的典型。

如果去除信號肽，會不會影響蛋白本身的表達？

蛋白表達強度不受信號肽調控，所以去除信號肽不會影響蛋白質表達。但是信號肽一方面參與蛋白質折疊成特定空間結構，另一方面其還決定蛋白最終被定位到特定的亞細胞區，一般蛋白只有在特定亞細胞區才能發揮其功能，所以信號肽對蛋白最終活性還是有很大影響的。

E. coli會去除成熟蛋白N-端的甲硫氨酸嗎？這種加工對目的蛋白的穩定性有何影響？

N-端fMet是否被去除受倒數第二個氨基酸影響。這個加工過程由甲硫氨酸氨基肽酶催化，并受以下關系支配：去除的困難程度隨倒數第二位氨基酸的支鏈大小的增加而降低。研究者在實驗中發現以下氨基酸種類出現在倒數第二的位置上時，此加工過程極少發生或根本沒有發生：His、Gln、 Glu、Phe、Met、Lys、Tyr、Trp和Arg。而當倒數第二位上是其它種類的氨基酸時，加工過程發生的可能從16%到97%，確定了在大腸桿菌中蛋白氨基末端氨基酸與其穩定性之間的關系，也即“N-端原則”。具他們報導：如果下列氨基酸位于氨基端時蛋白的半衰期僅為2分鐘：Arg、 Lys、Phe、Leu、Trp和Tyr。相反，其它氨基酸位于氨基端時可以使受檢蛋白的半衰期長達10小時以上。綜上兩條研究可以得出結論：Leu在氨基末端時很容易因為fMet被去除而暴露出來，從而導致蛋白的迅速水解。顯然，當采用pET載體上的 Nco I 或 Nde I位點表達非融合蛋白時，完全不必擔心Leu的密碼子出現在倒數第二的位置上。

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